| StemSpan™白血病细胞培养试剂盒用于体外扩增恶性细胞，并且已经被测试用于原代慢性髓性白血病（CML）和急性髓性白血病（AML）患者的样本。使用该优化流程可以扩增培养恶性细胞并将其应用于后续的研究或药物筛选。该试剂盒包含无血清培养基SFEM II (货号 #09605), StemSpan™ CD34+ 扩增添加物 (10X; 货号 #02691), 和小分子UM171 (货号 #72912)。由于UM171已经停产，此处可由UM729代替。 |
优点： |
| - 优化用于人骨髓白血病细胞的培养、扩增和药物筛选;- CD34+ CML 细胞65倍扩增; CD34+ AML细胞的30倍扩增。 |
数据： |
| 图1. 分离白血病CD34+细胞解冻冻存的CML或AML PBMC和BMMC进行分离。用EasySep™人脐血CD34阳性选择试剂盒Ⅱ分离CD34细胞，流式细胞仪检测CD34细胞分离前后(A，C)和(B，D)的百分率。通过散射光和活力染色排除死细胞。本实验中，CD34细胞纯度从3%提高到82%(CML)，从16%提高到93%(AML)。图2 扩增CD34 慢性髓系白血病（CML）细胞在含有和不含UM 171的添加了CD34扩增添加物的StemSpan™SFEMⅡ中进行扩增CD34 慢性髓系白血病（CML）细胞。培养7d和14d后，用CD45、CD34、CD90、CD45RA荧光抗体染色，用ALDEFLUOR™(货号#01700)检测细胞内乳酸脱氢酶活性，流式细胞仪分析。依次设门检测CD45+、CD45+CD34+和CD45+CD34+CD90+CD45RA-细胞(以FMO为对照)和ALDHbr细胞(基于DEAB对照)的百分率。(A)第7天典型的流式细胞特征。观察到(B，C)第7天和(D，E)第14天的每个初始CD34细胞的(B，D)频率和(C，E)数量。添加了CD34 扩增添加物的StemSpan™SFEM II支持CML细胞的体外培养和扩增。添加了UM171促进了所有亚群的扩增(与不含UM 171的培养相比，培养7天CD34祖细胞有10倍扩增，第14天有20倍)。图 3. CD34+ AML 细胞扩增在单独添加CD34扩增添加物或者UM171的StemSpan™ SFEM II 扩增培养基中培CD34 AML细胞。培养7天和14天后，用荧光抗体和ALDEfluor™试剂对培养的细胞进行染色，如图2所示。 (A)第7天的代表性流图。 在(B，C)第7天和(D，E)第14天，每个初始CD34细胞的(B，D)扩增效率和(C，E)细胞数。添加了CD34扩增添加物的SFEMI I支持AML细胞的扩增。 添加UM171能进一步增强效率和细胞数(与未添加UM171的相比，第7天扩增强效率和细胞数增长了3倍，第14天扩增了7倍)。 显示的数据是平均±sem(n=6)。测试的10个AML样品中有6个能够在培养中扩增。图4 .培养过程中保持了 CD34+CML细胞的CFU形成能力用MethoCult™ H4435检测CD34CML细胞（直接分离、添加和未添加UM171培养7天和14天）的CFU形成能力。在StemSpan™ SFEM II +CD34扩增添加物和StemSpan™ SFEM II +CD34扩增添加物+UM171中培养14天的克隆用（A）STEMvision™自动计数和手动计数。(B) CFU 的数量作为每个原始输入的CD34形成克隆的总量。每个独立的柱状图上的数字表明BCR-AB L阳性克隆的比例，用qRT-PCR测量6个不同样品的挑取单个克隆（每个样品每个试验条件挑取8-12个克隆）。SFEM II + CD34+扩增添加物支持CFU祖细胞的扩增。 UM171 进一步促进CFU祖细胞的形成 (扩增7天3.5倍，扩增14天7倍)。从第0天、第7天和第14天产生的克隆，挑取单克隆进行qRT-PCR分析显示，主要表达BCR-ABL+，但是正常的BCR-ABL-祖细胞也以低频率存在。显示的数据是平均±sem(n=6)。P-values were calculated using a two-tailed paired Student’s t-test (*P < 0.05).Figure 5. Colony-Forming Potential of CD34+ AML Cells is Maintained During CultureAML cells, after CD34+ cell isolation (day 0) or after 7 or 14 days of expansion without or with UM171 (as described in Figure 3), were plated in colony assays with MethoCult™ H4435 Enriched medium. After 14 days of incubation, colonies were (A) imaged with STEMvision™ and counted manually from digital images. (B) CFU output expressed as the total number of colonies per original input CD34+ cell. SFEM II supplemented with CD34+ Expansion Supplement (Exp) supports the expansion of colony-forming progenitor cells in culture. Addition of UM171 further promotes colony-forming progenitor cell output (~3-fold expansion at day 7 and ~4-fold at day 14). Data shown are mean ± SEM (n = 6). P-values were calculated using a two-tailed paired Student’s t-test (*P < 0.05) |
组成成分： |
▪StemSpan™ SFEM II, 100 mL (货号 #09605) ▪ StemSpan™ CD34+ 扩增添加物 (10X), 1 mL (货号 #02691) ▪UM171, 250 µg (货号 #72912) |
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